一、项目简介

本发明涉及微生物合成生物学、基因工程和分子生物学领域，具体涉及CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法。尽管DNA的合成成本随着技术的进步而不断降低，然而超大片段的DNA甚至是完整基因组的组装由于受限于大片段DNA的操作困难，效率仍然是比较低的。本系列发明为高效拼接大片段的DNA和连续克隆长的DNA片段、低成本短时间高校迭代无缝拼接超大DNA片段，提供了具体可行的方法和系统，可应用于完整基因组的组装。

二、专利摘要

本系列发明公开了CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法；提供用于构建长DNA片段的多核苷酸、核酸构建物、方法和系统，所述多核苷酸包含：双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点。具体而言，本发明提供能在酵母中组成型表达Cas9的核酸构建物，该核酸构建物含有与cas9基因操作性连接的酵母Tef1启动子，来自pBR322的复制起始位点及其筛选标记和来源于CEN6ARS4的复制区及其筛选标记，所述核酸构建物在酵母中为单拷贝复制，在大肠杆菌中为高拷贝复制。本发明还提供能在酵母中组成型表达sgRNA的核酸构建物、作为受体载体使用的核酸构建物以及DNA拼接方法。利用本发明可将两个以上待拼接大DNA片段直接在酵母菌中一次成功拼接为大质粒，省去了低效率的大片段DNA的体外酶切回收及遗传转化等操作，比传统方法更方便高效。

三、专利状态

本技术已递交中国专利申请，申请号：201510531714.X，已获授权；申请号202110171187.1，实质审查中；持有人项目编号：SIBS15-033、SIPPE20-64。

四、持有单位

中国科学院分子植物科学卓越创新中心。

五、合作方式

转让、许可或合作研发。

六、联系方式

张雯，wzhang@cemps.ac.cn，021-54924138。