CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法和连续克隆长DNA片段的方法和系统
一、项目简介
本发明涉及微生物合成生物学、基因工程和分子生物学领域,具体涉及CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法。尽管DNA的合成成本随着技术的进步而不断降低,然而超大片段的DNA甚至是完整基因组的组装由于受限于大片段DNA的操作困难,效率仍然是比较低的。本系列发明为高效拼接大片段的DNA和连续克隆长的DNA片段、低成本短时间高校迭代无缝拼接超大DNA片段,提供了具体可行的方法和系统,可应用于完整基因组的组装。
二、专利摘要
本系列发明公开了CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法;提供用于构建长DNA片段的多核苷酸、核酸构建物、方法和系统,所述多核苷酸包含:双链切割识别位点,转移起始位点oriT,复制起点。具体而言,本发明提供能在酵母中组成型表达Cas9的核酸构建物,该核酸构建物含有与cas9基因操作性连接的酵母Tef1启动子,来自pBR322的复制起始位点及其筛选标记和来源于CEN6ARS4的复制区及其筛选标记,所述核酸构建物在酵母中为单拷贝复制,在大肠杆菌中为高拷贝复制。本发明还提供能在酵母中组成型表达sgRNA的核酸构建物、作为受体载体使用的核酸构建物以及DNA拼接方法。利用本发明可将两个以上待拼接大DNA片段直接在酵母菌中一次成功拼接为大质粒,省去了低效率的大片段DNA的体外酶切回收及遗传转化等操作,比传统方法更方便高效。
三、专利状态
本技术已递交中国专利申请,申请号:201510531714.X,已获授权;申请号202110171187.1,实质审查中;持有人项目编号:SIBS15-033、SIPPE20-64。
四、持有单位
中国科学院分子植物科学卓越创新中心。
五、合作方式
转让、许可或合作研发。
六、联系方式
张雯,wzhang@cemps.ac.cn,021-54924138。