一、项目简介

本技术属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法。本发明方法可以产生预定粘端，并可用于体外DNA无缝拼接。本发明提供了一种高通用性、高特异性、并对识别位点与切割位点进行有效分开的体外核酸切割和拼接方法。具体地，基于本发明方法，不仅可以使得产生例如长度为5-8nt的预定序列的粘性末端，从而提供后续拼接的特异性和效率，并且可以有效解决长片段（如≥1kb、≥2kb、或≥5kb）DNA片段在切割和拼接时缺乏合适的特异性切割位点的问题,因此特别适用于长片段核酸（如DNA分子）的切割和拼接。

再具体地来说，本发明人通过对不同长度 crRNA介导Cpf1切割靶标DNA的特点进行系统的改造,并通过改造设计特定 crRNA，采用特定长度的核苷酸的Cpf1识別区，从而使得Cpf1的个或两个切割位点能够移动到Cpf1识别区之外，从而显著增加了这类 crRNA介导Cpf1切割反应的灵活性。在此基础上，还开发了一种体外DNA无缝拼接的技术方案。实验结果表明，采用上述技术方案成功地完成了阿泊拉抗性基因（apr）无缝拼接和放线紫红素生物合成基因簇中途径特异性调控因子aetII-orf4启动子的替换。

二、专利摘要

本发明涉及一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法。所述方法通过设计并合成能够被CRISPR?Cpf1识别的特异crRNA序列来引导Cpf1特异地将双链DNA的特定位置切开并生成预设的粘性末端。利用本发明的方法,可方便、快捷、准确地获得预定的粘性末端，对DNA进行拼接。使用本发明的方法能够对DNA进行工程化、标准化、模块化的改造或组装。

三、专利状态

本技术已递交中国专利申请，申请号：201610877438.7，已获授权；持有人项目编号：SIBS16-048。

四、持有单位

中国科学院分子植物科学卓越创新中心。

五、合作方式

转让、许可或合作研发。

六、联系方式

张雯，wzhang@cemps.ac.cn，021-54924138。