逆境中心朱健康研究组利用CRISPR/Cpf1系统简单高效实现水稻多基因定点编辑

3月19日，Molecular Plant杂志在线发表了植物逆境中心朱健康研究组题为“Multiplex Gene Editing in Rice using the CRISPR-Cpf1 System”的研究论文。该工作在水稻中利用CRISPR/Cpf1系统实现多基因位点编辑，效率达到40-75%；同时该系统在载体构建上比CRISPR/Cas9系统更加简单易行。该工作为水稻多基因定点编辑提供了一个简单高效的新工具。

CRISPR/Cas9系统在基因定点编辑方面已经得到了大量的应用，然而CRISPR/Cas9系统依然存在着一定的局限性。在CRISPR/Cas9系统中，需要CRISPR转录形成RNACRISPR RNA (CrRNA)与反式作用型CrRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)两种小RNA分子，两种RNA分子部分区域配对形成复合体。随后，该复合体引导具有非特异核酸酶活性的Cas蛋白切割与crRNA匹配的DNA序列。因此，工程化的CRISPR/Cas9系统也需要将CrRNA与tracrRNA融合在一起形成单一的chimeric RNA(chiRNA)，并且需要在宿主RNA酶的帮助下才能发挥作用。同时，利用该系统进行单次多基因定点编辑时，载体系统构建复杂，每一个定点编辑位点均需要单独的启动子和终止系列。

近年来，科学家发现并改造出Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1)系统，研究表明该系统能克服CRISPR/Cas9的上述局限，它不需要tracrRNA的辅助，并且Cpf1蛋白兼具DNA剪切酶和RNA修剪酶的功能，不但能靶向切割DNA双链，而且能把相应的非成熟型CrRNA(pre-crRNA)加工剪切成成熟型CrRNA。

逆境中心朱健康研究组利用Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1)和 Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1 (LbCpf1)对水稻进行单位点和多位点基因敲除的测试，研究表明上述两个Cpf1只需一条非常短的20-21bp的直接重复序列（direct repeats, DR）加上22-24bp的靶位点识别序列（guide）即可实现单基因敲除，更重要的是，把多个DR-guide单元直接串联，只需要一个启动子驱动即可简单高效地实现多基因敲除。该研究利用4个DR-guide单元组成的CrRNA短阵列分别对水稻RLK和CYP81A家族的四个基因进行编辑，各位点的敲除效率达到40-75%。该系统简单、高效地在水稻中实现了多基因定点编辑，拓展了CRISPR系统在植物中的应用，为水稻基因组定点编辑提供了一个新利器。

该工作得到了中国科学院的经费支持。

T-DNA constructs of FnCpf1 and LbCpf1 for multiplex gene editing in rice and the resulting mutagenesis efficiency in rice