抗逆中心朱健康团队在植物中实现A·T- G·C的单碱基替换

2月22日，Molecular Plant 杂志在线发表了抗逆中心朱健康研究组题为“Precise A·T to G·C base editing in the rice genome" 的研究论文。该研究报道了一种新型腺嘌呤碱基编辑器ABE7-10在水稻中的应用。它可以将水稻基因组特定位点的上A·T 碱基对高效的转化为 G·C碱基对。此研究扩展了植物中可用的单碱基编辑工具，同时将进一步推动水稻等其他作物的分子精准育种。

碱基置换突变指一个碱基被另一个碱基取代，是最常见的突变形式。越来越多的研究表明，大部分生物性状的改变都存在着相关基因的突变，其中以碱基置换突变即点突变最为常见。寻求高效的单碱基编辑技术一直以来都是植物研究的热点和难点。 2017年10月，哈佛大学的David Liu实验室在Nature上发表了题为“Programmable base editing of A？T to G？C in genomic DNA without DNA cleavage”的研究论文，他们报道了一种新型的腺嘌呤碱基编辑器ABE，可以将基因组中特定位点的A·T 碱基对高效的转化为 G·C碱基对。该研究进一步扩展了目前基于CRISPR/Cas9的单碱基编辑工具。但是ABE是以大肠杆菌tRNA腺嘌呤脱氨酶为基础，经过了7轮的突变进化改造而得到的，虽然它能对哺乳动物细胞中的多个位点能够进行高效碱基编辑，但在植物中是否也可以高效利用尚不清楚。

基于哺乳动物细胞中已经发表的结果，抗逆中心朱健康研究组在水稻中开发了一种新的腺嘌呤碱基编辑系统。研究人员合成了野生型TadA和其突变形式TadA7-10，并将其用特定的街头连接到Cas9（D10A）的N端，同时将VirD2的核定位信号肽（NLS）添加到Cas9（D10A）的C末端，形成ABEP1腺嘌呤碱基编辑器。ABEP1在水稻中由玉米泛素启动子驱动表达。研究人员首先选择对水稻基因组中的OsSPL14和SLR1位点进行单碱基编辑，A·T 到 G·C的替换的效率分别为26%和12.5%。为了证实该碱基编辑器能够同时对基因组多个靶位点同时进行编辑，研究设计了单个sgRNA同时靶向基因组中的多个位点。结果表明水稻基因组多个位点可以被ABEP1同时编辑。ABEP1依赖于SpCas9识别靶位点，而SpCas9识别靶位点依赖于NGG PAM序列，这限制了水稻基因组中可被编辑的位点。为了进一步扩展水稻基因组中可被编辑的位点，研究设计ABEP2腺嘌呤碱基编辑器，其识别靶位点依赖于SaCas9。而SaCas9识别靶位点依赖于NNGRRT PAM序列。对水稻基因组的多个基因进行定点编辑表明ABEP2同样能够对目标位点进行高效的碱基替换，有些位点的效率高达61.3%。于此同时，ABEP2可以对多个位点进行同时编辑。对所有的编辑位点测序后研究人员发现没有任何位点产生碱基插入、缺失或者其他形式的碱基替换，说明腺嘌呤碱基编辑器精确性很高。

结合本组此前开发的基于APOBEC1酶的碱基编辑器，目前可以在水稻基因组中实现对DNA四种不同碱基的高效替换（A-G, T-C, C-T, G-A）。这将进一步推动水稻功能基因组研究同时对作物分子精准育种产生重大影响。

抗逆中心博士研究生华凯为该论文第一作者，朱健康研究员为通讯作者。生物技术平台为该研究提供了技术支持。该工作得到中科院的相关经费资助。

A.水稻中两种腺嘌呤碱基编辑器的载体示意图
B.OsSPL14中的靶位点示意图，miR156结合位点由红色字体标出
C.两株代表性的转基因植株的测序峰图，黑色箭头指示出编辑位点
D.不同sgRNA编辑效率的统计信息