2019年9月25日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了来自中国科学院分子植物科学卓越创新中心上海植物逆境生物学研究中心Daisuke Miki研究组和朱健康研究组合作的题为“Gene targeting in Arabidopsis via an all-in-one strategy that uses a translational enhancer to aid Cas9 expression”的研究论文。该研究在原来的基础上，实现了一步到位（all-in-one）的基因打靶方法。

　　在该研究中，将Cas9蛋白、gRNA和HR修复供体序列一次性全部设计在同一个载体上进行一次转化（如下图所示）。此外，该研究还增加源于TMV的Ω翻译增强子序列以增强Cas9蛋白的表达，在HR供体序列两侧增加sgRNA识别位点及使用具有EC1.1启动子的嵌合EC1.2 / DD45增强子来驱动Cas9表达。

　　该研究发现，在不使用增强子等元件的条件下，基因敲入的效率只有0.68%。而通过利用源于TMV的Ω翻译增强子序列增强Cas9蛋白的表达，在DD45启动子的驱动下，能将基因敲入的效率提高3倍，达到2.4%。此外，研究发现，EC1.2/DD45的增强子配合EC1.1启动Cas9蛋白的表达，在该体系中并没有效果。在HR供体序列两侧增加sgRNA识别位点，也不能增加基因敲入的效率。

　　该研究表明，尽管使用all-in-one策略进行基因打靶的效率低于两步法的效率，但是在未来的工作中，将进一步优化all-in-one策略，提高基因打靶的效率，使其能更高效地应用于拟南芥的任一生态型或者基因组背景植株，或其他能使用浸花法转化的高等植物。

　　本研究得到了中国科学院的资助。彭方楠硕士和张文心硕士为论文的共同第一作者，Daisuke Miki研究员和朱健康研究员为论文的共同通讯作者。

　　论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/pbi.13265