糖胶树（Alstonia scholaris），又名灯台树，鸭脚树，隶属于夹竹桃科鸡骨常山属，广泛分布于东南亚、南亚和亚热带地区, 是传统中成药灯台叶颗粒、灯台叶片的主要成分。具植物志记载，糖胶树的根、树皮、叶均含有生物碱，供药用。根皮、树皮可治头痛、伤风、肺炎、慢性支气管炎等。糖胶树含有丰富的吲哚生物碱，akuammilan类生物碱是其中一大类具有抗癌、抗菌、抗疟等多种生物活性的单萜吲哚生物碱，有着独特的methanoquinolizidine笼状结构，不仅在化学合成上极具挑战性，控制其生物合成途径的基因也至今尚未得到解析。

　　2022年10月13日，国际学术期刊Chemical Science在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心Evangelos Tatsis研究组题为“Deciphering and Reprogramming the Cyclization Regioselectivity in Bifurcation of Indole Alkaloids Biosynthesis”的研究论文。该研究基于转录组和基因组挖掘以及生化实验首次解析了编码akuammiline生物碱的生物合成过程，利用分子建模和定点突变试验剖析了两个关键p450合成akuammilan生物碱和strychnos生物碱的催化机理。该工作不仅为全面解析akuammilan家族生物碱的生物合成途径奠定基础，也为新药设计提供了依据。

　　据已有的文献分析，单萜吲哚生物碱的生物合成都可源于共同的前体strictosidine，并在SGD的催化下合成geissoschizine分子骨架，之后经过不同P450酶的催化下，合成不同类型的单萜吲哚类生物碱。sarpagan bridge enzyme (SBE) 催化geissoschizine的 C5-C16 环化形成sarpagan类型生物碱的基本骨架。geissoschizine oxidase(GO)催化 geissoschizne C2-C3 键断裂，C2-C16，C3-C7键形成，形成strychnos类型生物碱的基本骨架。从结构出发，研究人员推测akuammilan类型生物碱的基本骨架通过一个P450酶对geissoschizne的C7-C16 环化而生成。

　　研究人员首先对糖胶树的基因组以及转录组数据进行组装，挖掘了可能涉及Akuammilan类生物碱rhazimal、rhazimol和akuammiline生物合成的基因，并通过异源表达纯化蛋白和酵母共表达系统确认了基因编码酶的活性。鉴定了催化geissoschizine环化重排的P450酶RHS(rhazimal synthase), 两个还原rhazimal为rhazimol的乙醇脱氢酶RHR(rhazimal reductase),两个合成akuammiline的乙酰转移酶AKS(akuammiline synthase)。

　　同为P450酶的RHS和GO是如何做到利用相同的底物geissoschizine分别产生Akuammilan类型和strychnos类型的单萜吲哚类生物碱的？研究人员对RHS和GO进行了分子建模和突变试验，发现第372位的苯丙氨酸(RHS)和缬氨酸(GO)是控制其生物活性的关键性位点，推测可能是第372位氨基酸侧链大小的不同改变了底物在活性位点的位置，影响了底物与血红素的相互作用，从而影响了酶的功能活性。

　　基于分子模型和突变体体外酶活实验，研究人员提出了RHS可能的催化机制。 RHS优先氧化geissoschizine的C7，随后失去一个水分子，紧接着C16亲核攻击C7的碳正离子，从而形成了akuammilan类型生物碱的rhazimal。

　　中科院分子植物科学卓越创新中心的博士生王卓、肖伊人为该论文的共同第一作者，Evangelos Tatsis研究员为通讯作者。该研究团队同时隶属于中国科学院与英国约翰·英纳斯中心合作共建的国际联合单元植物和微生物科学联合研究中心(CEPAMS)。该工作得到了代谢组学平台、国家基因研究中心、中科院西双版纳植物园陈江华研究员和中科院有机化学研究所李昂研究员的支持与帮助。该研究工作得到基金委外国优秀青年学者研究基金、中科院国际合作伙伴项目、植物分子遗传学国家重点实验室等的资助。

　　论文链接: https://doi.org/10.1039/D2SC03612F

夹竹桃科植物的单萜吲哚类生物碱的代谢途径概述

AsRHS和AsGO活性位点的分子建模和突变