二苯甲酮和呫吨酮是具有C6-C1-C6碳骨架的两类多酚化合物，由于其光物理特性，在工业和医药领域被广泛应用。在自然界中，二苯甲酮和呫吨酮广泛存在于细菌、真菌和植物中，但是这两类化合物中的绝大多数(约80%)主要是从植物中分离出来的。藤黄属(Clusiaceae)树木的可食用果实中富含二苯甲酮和呫吨酮，在东南亚的一些国家，藤黄果和山竹(水果皇后)是非常受欢迎的水果，对人体的健康有益，当地人食用这些水果用于减肥、治疗腹泻等疾病。

　　藤黄植物中的二苯甲酮和呫吨酮，其结构骨架通过在多个位置进行羟基化、异戊二烯等功能修饰生成各种复杂的结构，如二苯甲酮衍生物 garcinol 和 oblongifolin C；呫吨酮衍生物gambogic acid和 α-mangostin，这些化合物已被提议作为新型抗癌药物的探针，是潜在的高效低毒抗肿瘤药物。并且它们还具有广泛生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗病毒、抗寄生虫、抗炎特性。

　　据已有的文献分析，二苯甲酮是呫吨酮的前体，二苯甲酮通过分子内环化生成呫吨酮，然而，藤黄属植物中大部分二苯甲酮类化合物(如garcinol, oblongifolin A)在结构上并没有分子内环化，虽然也经历了多种功能修饰，但保持其基本的二苯甲酮骨架，这说明植物中或许存在着一种羟基化酶，可以控制开环或闭环反应，决定C6-C1-C6碳骨架生成二苯甲酮或呫吨酮两种不同类型的化合物。

　　2022 年 10 月25日，催化领域Top期刊ACS Catalysis在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心Tatsis研究组题为“Decoding the cytochrome P450 catalytic activity in divergence of benzophenone and xanthone biosynthetic pathways”的研究论文。该研究基于转录组和代谢组学分析，以及生化实验首次解析了决定二苯甲酮和呫吨酮合成的关键基因，通过蛋白质理性设计，构建了不同位阻碍活性口袋的蛋白酶突变体，提高了酶催化效率，保证了的定向产物的酶促合成。

　　研究人员首先通过对5种不同藤黄属植物中山竹子素(Garcinol)含量的分析，选择大叶藤黄建立转录组数据库，以用于发现作用于二苯甲酮的羟基化酶。以鉴定并表达的二苯甲酮基因BPS为诱饵，通过自组织映射和层次聚类的共表达分析，筛选下游潜在控制开环闭环反应的羟基化酶，并通过异源表达纯化蛋白鉴定了3个细胞色素P450酶，其中CYP1(GxCYP81AA4)催化底物发生分子内环化，是二苯甲酮转变为呫吨酮的关键酶；CYP10(GxCYP71AH51)具有呫吨酮-6-羟基化活性(X6H)，酶活反应生成的1,3,6,7-四羟基呫吨酮是绝大多数呫吨酮类化合物的代谢前体，曾有研究在植物组织研磨液中发现X6H活性，这里的CYP10是第一个报道具有X6H活性的基因。

　　研究中报道的CYP3(GxCYP81AA5)是具有双功能的酶，催化底物2,4,6-triHB的C(3’)和C(4’)处的两个串联的羟基化反应，此时底物并不发生分子内环化反应，产物为2,3',4,4',6-五羟基二苯甲酮，维持了二苯甲酮基本的骨架。由于藤黄属植物中富含大量的Polycyclic Polyprenylated Acylphloroglucinol，PPAP(多环多异戊烯基酰基间苯三酚)化合物，前体2,3',4,4',6-五羟基二苯甲酮是PPAP化合物的重要前体，因此CYP3的鉴定和发现对于后续开发利用PPAP化合物具有里程碑的意义。

　　研究人员通过基因序列比对发现CYP1和CYP3具有高度同源性，虽然质谱分析结果表明这两种酶的产物有所交叉，但其对应主产物仍是二苯甲酮或呫吨酮。为了探究细胞色素P450作用于二苯甲酮底物的作用机理，研究人员应用建模工具Alphafold2构建了CYP3蛋白的三维结构。通过CYP3底物识别位点和分子对接实验，确定了酶活性口袋中影响酶与底物结合构效的关键残基V375，通过理性设计将其突变成侧链位阻较小的丙氨酸，使得酶底物活性口袋容积扩展，底物翻转，发生分子内环化生成呫吨酮，而当其突变成侧链位阻较大的亮氨酸时，口袋变小底物被限制在特定结合区域，底物只发生两部串联的羟基化生成双羟基二苯甲酮。

　　此外，研究人员还发现S479和K480这两个位点可能是底物进入通道的重要组成部分，进一步通过对这两个位点进行人工改造，实现了该蛋白的功能优化，使得酶活力及催化效率得到了明显的提升，最终实现了底物催化生成特定产物，为该类酶的后续改造与应用研究奠定了良好的基础。

　　中科院分子植物科学卓越创新中心已毕业博士生王亚为该论文的第一作者，Evangelos Tatsis研究员为通讯作者。该研究团队同时隶属于中国科学院与英国约翰·英纳斯中心合作共建的国际联合单元植物和微生物科学联合研究中心(CEPAMS)。该工作得到了代谢组学平台、国家基因研究中心、中科院西双版纳植物园的支持与帮助。研究工作得到中科院先导专项、国家重点实验室、中心引进人才项目、中科院中国博士后科学基金会国际交流项目等的资助。

　　论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.2c03405

图. 改造CYP3以促进2,3',4,4',6-五羟基二苯甲酮的合成