2023年2月24日，国际学术期刊Plant Physiology在线发表了中科院分子植物科学卓越创新中心黄朝锋研究组题为“PP2C.D phosphatase SAL1 positively regulates aluminum resistance via restriction of aluminum uptake in rice”的研究论文。该研究发现水稻PP2C.D磷酸酶SAL1通过抑制质膜H⁺-ATPase活性限制铝转运蛋白NRAT1介导的铝吸收从而正调控抗铝毒，而拟南芥PP2C.D磷酸酶则通过限制苹果酸分泌负调控抗铝毒的新机制。

　　铝毒是作物在酸性土壤生产的主要限制因子，也是仅次于干旱的第二大非生物逆境。超过80%的铝离子都结合到细胞壁，抑制细胞壁的延伸性和功能，从而抑制根的伸长。一部分铝离子也能够进行细胞内进行毒害，包括损害细胞骨架、信号转导、线粒体功能、DNA结构等。虽然大多数铝离子结合到细胞壁，但是关于细胞壁和细胞内的铝离子毒害哪个更重要仍存在争议。

　　植物进化了多种抗铝毒机制，其中一个广泛的、关键的抗铝毒机制是植物根通过分泌有机酸，如苹果酸、柠檬酸和草酸，对铝离子进行螯合和解毒。不同的植物可能通过分泌不同的有机酸进行解铝毒。其中，拟南芥主要通过分泌苹果酸来解铝毒，虽然它也能分泌更少量的柠檬酸帮助抗铝毒。水稻是一个高抗铝毒的作物，它能够分泌少量柠檬酸抵御铝毒害，但是与其他植物相比，有机酸分泌在水稻抗铝毒过程中的贡献有限。目前，关于水稻与其它植物如拟南芥的差异性抗铝毒机制还了解甚少。

　　该课题采用正向遗传筛选鉴定了一个与已知突变体art1类似的对铝毒超敏感的突变体sal1 (sensitive to aluminum 1)；然而，与art1不同的是，sal1在第一天铝毒处理不表现对铝毒更敏感，而是在第二天铝毒处理表现对铝毒超敏感。该研究结果表明，sal1突变损害水稻的长期抗铝毒能力。生理分析实验表明，sal1突变促进了铝离子的吸收，从而导致sal1突变体对铝毒超敏感。

　　通过全基因组测序并结合分子标记连锁分析克隆了SAL1基因，它编码一个PP2C.D磷酸酶。sal1突变发生在该PP2C.D磷酸酶的第285位丙氨酸（Ala），使其替换为缬氨酸（Val）。体外酶活实验证明，SAL1是一个锰离子依赖的磷酸酶，sal1突变版本蛋白也具有磷酸酶活性，但其活性显著减弱。

　　铝毒能显著上调SAL1 mRNA的表达；相应地，SAL1蛋白含量在铝毒处理条件下也轻度增多。然而，铝毒能够显著抑制SAL1的磷酸酶活性。SAL1蛋白的第12、151、152位的半胱氨酸受到棕榈酰化的修饰，导致其定位于细胞质膜上。通过酵母双杂交筛选，发现一个质膜H⁺-ATPase OSA7与SAL1互作。由于PP2C.D磷酸酶家族成员在拟南芥中被报道能够抑制质膜H⁺-ATPase活性并且OSA7是水稻根中表达最高的质膜H⁺-ATPase基因，因此该论文重点研究SAL1对OSA7的调控。通过一系列的生化实验，证明了SAL1能够直接与OSA7互作，并通过去磷酸化作用抑制OSA7活性。铝毒和sal1突变都增强了质膜H⁺-ATPase的磷酸化和活性。外施钒酸盐（vanadate）能够挽救sal1对铝毒敏感的表型，而施加质膜H⁺-ATPase激动剂（fusicoccin）则增强野生型对铝毒的敏感性；通过RNAi降低OSA7表达能够挽救sal1的铝毒超敏感表型，而过量表达OSA7增强水稻对铝毒的敏感性。这些结果表明，sal1对铝毒的超敏感主要是由于升高的质膜H⁺-ATPase活性造成。

　　之前报道显示，质膜定位的NRAMP转运蛋白家族成员NRAT1介导了铝的吸收，敲除该基因导致更多的铝离子滞留在质外体，引起细胞壁中毒。由于NRAMP成员是质子驱动的转运蛋白，所以sal1突变促进铝吸收可能通过增强质膜H⁺-ATPase驱动NRAT1对铝的转运来实现。故此，该研究在sal1突变体背景敲除NRAT1基因。结果显示，nrat1突变能够完全挽救sal1对铝离子增强的敏感性和吸收能力；同时，sal1的突变也挽救了nrat1对铝毒的敏感性。这些研究结果进一步佐证，sal1和nrat1突变分别引起细胞内和细胞壁的铝中毒；同时揭示了协调和平衡细胞内和细胞壁的铝积累对水稻抗铝毒至关重要。

　　最后，作者研究了PP2C.D磷酸酶在拟南芥抗铝毒方面的作用。结果显示，敲除三个PP2C.D磷酸酶基因提高拟南芥的抗铝毒和苹果酸分泌能力；而质膜H⁺-ATPase AHA2的弱突变体表现对铝毒更敏感，以及分泌更少的苹果酸。综上所述，该研究揭示了质膜定位的PP2C.D磷酸酶SAL1通过对质膜H⁺-ATPase进行去磷酸化抑制其活性，限制铝转运蛋白NRAT1介导的铝吸收，从而正调控水稻抗铝毒的机制，以及揭示了拟南芥PP2C.D磷酸酶通过抑制苹果酸分泌负调控植物抗铝毒的不同的作用机制。此外，该研究进一步明晰了细胞内铝离子毒害的重要性，并发现细胞内铝毒害引起的根生长抑制需要较长时间来表现；同时揭示了铝在细胞内和细胞壁的平衡协作分布对水稻的抗铝毒至关重要。

　　博士后谢文香为论文的第一作者，黄朝锋研究员是该论文的通讯作者。该研究受到了国家自然科学基金面上项目和植物分子遗传国家重点实验室等的资助。

　　原文链接：https://academic.oup.com/plphys/advance-article/doi/10.1093/plphys/kiad122/7055984

质膜定位的SAL1通过去磷酸化质膜H+-ATPase抑制其活性，减少铝转运蛋白NRAT1介导的铝吸收，从而正调控水稻抗铝毒；拟南芥PP2C.D磷酸酶通过抑制苹果酸分泌来负调控其抗铝毒能力。