2023年6月15日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心王勇团队在ACS Catalysis杂志在线发表了题为"Discovery of Class I Diterpene Cyclases Producing a Tetracyclic Cephalotene Skeleton in Plum Yews"的研究论文。该研究首次报道了三尖杉属植物二萜生物合成途径的关键萜类环化酶，揭示了三尖杉烷型二萜的前体骨架三尖杉-12-烯的形成过程，为裸子植物二萜代谢多样性的起源和演化提供了深入见解。

　　三尖杉科三尖杉属植物（Cephalotaxus）生长缓慢，分布有限，受人类经济活动影响，部分物种处于濒危状态。我国特有三尖杉科十一个物种的六种。近年来，三尖杉属植物来源的生物碱和萜类化合物受到植物化学家的广泛关注，其中三尖杉烷型二萜具有独特而复杂的碳骨架和显著的抗肿瘤活性。例如，从海南粗榧（C. hainanensis）中获得的海南粗榧内酯（harringtonolide）具有抗肿瘤和抗病毒活性，对KB肿瘤细胞毒性达到IC50 = 43 nM。目前为止，对于三尖杉烷型二萜的研究主要集中于植物化学和有机合成领域，尚无关于三尖杉烷型二萜类化合物生物合成途径相关的功能基因解析。在裸子植物中，主要存在由I型和II型二萜合酶共同介导的赤霉素（gibberellins）及二萜树脂酸（diterpene resin acids）合成途径，而在红豆杉属（Taxus）、金钱松（Pseudolarix amabilis）等少数物种中也能够产生紫杉醇（paclitaxel）、土荆皮乙酸（pseudolaric acid）等特异性的二萜代谢产物，该类萜类骨架前体由I型二萜合酶直接催化香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）生成（图1）。

　　本研究首先通过挖掘三尖杉属植物柱冠粗榧（C. harringtonia）的转录组数据，结合二萜合酶保守结构域和系统发育分析推测了柱冠粗榧中二萜合成相关的萜类环化酶候选基因CharTPS1-7（图2），进一步运用本氏烟草瞬时表达体系和重组蛋白体外酶促反应等方式验证候选酶基因的生物学功能（图3）。结果表明：CharTPS4和CharTPS2分别为ent-CPS和ent-KS，参与赤霉素前体对映-贝壳杉烯（ent-kaurene）（化合物1）的合成；CharTPS5和CharTPS6为(+)-CPS，其产物(+)-CPP在CharTPS1作用下产生biformene（化合物2）。CharTPS7及其海南粗榧中的同源基因ChaiTPS7所编码的萜类环化酶与红豆杉来源的紫杉二烯合酶（TXS）具有近缘关系（蛋白相似性62%），能够直接催化GGPP生成一种未知的二萜母核（化合物3）。在本氏烟草中过表达CharTPS7后，通过分离纯化和波谱鉴定，鉴定产物3为含有7-6-6-5四环骨架的二萜母核三尖杉-12-烯（cephalot-12-ene）。为了阐明CharTPS7的环化催化机制，研究者利用基因编辑技术构建了从头合成三尖杉-12-烯的大肠杆菌菌株，借助体内同位素标记示踪并结合量子化学计算推测了三尖杉-12-烯的合成途径（图4）。利用同源建模和定点突变，发现CharTPS7的第625位苯丙氨酸残基是影响催化特异性的关键位点（图5），F625的突变体能够产生一系列具有二环结构的轮枝三烯（verticillatriene）衍生物和具有三环结构的紫杉二烯（taxadiene）产物。

　　本研究阐明了三尖杉属植物中I型二萜合酶驱动的碳正离子级联反应，是三尖杉烷型二萜类化合物生物合成途经解析的一个重要突破，深化了我们对于裸子植物二萜代谢多样性的遗传基础的理解，为进一步利用合成生物学开发和创新具有较高药用价值的三尖杉烷二萜奠定了基础。

　　中国科学院分子植物科学卓越创新中心王勇研究员和孙雨伟副研究员为该论文的通讯作者，博士研究生王光义、冯占广以及李建华高级工程师、华东理工大学任宇红教授参与了相关工作，中心公共服务平台徐晓燕、胡文利、蓝文贤和植物分子遗传国家重点实验室李大鹏研究员在化合物结构鉴定相关工作提供了帮助。该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金及植物分子遗传国家重点实验室的资助。