2023年12月15日，国际著名学术期刊New Phytologist在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿研究组联合齐鲁师范学院玉米分子育种研究院路小铎研究组合作完成的题为“Maize DDK1 encoding an Importin-4 protein is essential for seed development and grain filling by mediating nuclear exporting of eIF1A”的研究论文，该研究首次发现并报到了核转运蛋白参与调控玉米籽粒发育机制。

　　玉米（Zea mays）是世界上最主要的粮食、饲料和生物燃料生产作物之一，也是研究籽粒发育和灌浆的优良模式植物。玉米籽粒发育始于双受精，即花粉中的两个精子分别与卵细胞和中央极核融合，受精卵发育为二倍体胚胎而受精极核发育为三倍体胚乳。克隆和解析调控玉米籽粒发育和灌浆的关键基因，对提高玉米产量和品质具有重要的农业生产指导意义。胚乳发育和储藏物质合成受到精密的遗传网络调控。目前已报道了多个转录因子在转录水平上直接调控胚乳储藏物质合成，包括O2、PBF1、OHP、NAC128/130、OHP1/2、ZmbZIP29、ZmABI19、NAC128/130、O11等，但在翻译水平上的调控还研究较少。

　　在真核生物中核膜将转录和翻译两个生物学过程分隔在不同的区室。生物大分子的跨膜运输主要由核转运蛋白介导（karyopherin），根据其转运方向不同，可以分为核输入蛋白（Importin）和核输出蛋白（Exportin）。在细胞质Importin识别并结合底物，通过核孔复合物（NPC）转运到细胞核，在细胞核内Importin结合RanGTP后促进底物释放。在细胞核内Exportin结合RanGTP后促进其结合底物，通过NPC转移到细胞质，在细胞质GTP水解为GDP后，促进底物释放。核转运蛋白及其底物在动物中得到了大量研究，2022年德国生物化学家迪尔克 格尔利希（Dirk Gorlich）教授因其“对于蛋白质在细胞质和细胞核之间运输的机理及其选择性的关键发现“获得首届世界顶尖科学家协会奖—生命科学或医学奖”，但目前核转运蛋白在植物中研究较少。

　　研究团队通过EMS化学诱变筛选获得了一个玉米籽粒突变体，该突变体成熟的籽粒变小，但是能够完成营养生长和生殖生长。进一步研究发现，突变体从早期胚乳细胞化到细胞分化进程均延迟，授粉后6天的胚乳细胞数目显著少于野生型。早期胚乳细胞数目的多少，对于成熟籽粒的大小具有决定性的意义，因此我们认为突变体籽粒变小的原因是早期胚乳细胞数目减少所导致。由于突变体在灌浆期淀粉体和蛋白体的填充进程显著慢于野生型，因此我们将其命名为developmentally delayed kernel 1 (ddk1)。

　　Ddk1编码植物特异的Importin-4 蛋白，在突变体中该基因上包含一个SNP，该SNP并没有影响mRNA表达水平，但导致蛋白质氨基酸序列的改变（G292D），从而能影响了蛋白质的稳定性，导致在ddk1中不能检测到DDK1^G929D的积累。DDK1在单子叶和双子叶植物中具有保守性，在授粉后不同天数的籽粒均有表达。为了探究Ddk1可能参与的生物学过程，我们对授粉后不同天数的籽粒进行了转录组分析，我们一共筛选到了334个共有差异表达基因，其中237个上调差异表达基因，其主要参与了蛋白质的合成等生物学过程。核糖体作为蛋白质组装的机器，Ddk1突变后导致籽粒发育延迟却诱导大量核糖体编码基因显著上调表达，这可能是由于ddk1蛋白质的合成速率降低的一种正反馈调节。进一步通过多聚核糖体分析和SUnSET证实Ddk1突变确实导致蛋白质合成速率显著降低。

　　为了探究DDK1是如何在翻译水平上调控玉米籽粒发育，通过酵母双杂交文库筛选获得DDK1的潜在底物，阳性克隆中有80%的基因都编码eIF1A，进一步我们验证了DDK1和eIF1A能够在植物体内相互作用。eIF1A编码真核生物翻译起始因子1A，在翻译起始过程中能够结合到40S核糖体上，促进其构象的改变，进一步促进起始密码子的扫描。在动物中的研究发现，由于eIF1A（16.8 kD）分子量较小，因此能够自由扩散到细胞核，但是翻译是被限制在细胞质，因此必须依赖一个高效的转运因子，将细胞核的eIF1A转运到细胞质，从而满足下游翻译需求。我们发现DDK1在体外不能直接结合eIF1A，当DDK1结合RanGTP后，能够促进其识别并结合eIF1A。进一步我们通过免疫荧光分析发现，在野生型中eIF1A主要积累在细胞质，而在ddk1中eIF1A大量积累在细胞核。说明DDK1充当Exportin来介导eIF1A出核转运。进一步在胚乳中特异的敲低eIF1A后，会导致胚乳的灌浆缺陷，说明eIF1A能够在翻译水平上调控玉米籽粒的发育。

　　该研究首次克隆并报到了核转运蛋白能够参与调控玉米籽粒的发育，同时阐明了DDK1/eIF1A模块作用机制，为未来分子设计育种提供了潜在靶标。由于DDK1和eIF1A在不同植物中都非常保守，因此该作用机制在不同植物中是保守的。

　　中国科学院分子植物科学卓越创新中心巫永睿研究组博士研究生黄兴为该论文的第一作者，四川农业大学黄永财教授、齐鲁师范学院青年教师秦莉等也参与了该项工作。巫永睿研究员与路小铎教授为该论文的通讯作者。该研究得到国家自然科学基金重点项目、中国科学院先导科技专项（B类）项目的资助。

　　论文链接：http://doi.org/10.1111/nph.19475

图1 Ddk1成熟籽粒表型

图2 DDK1介导eIF1A出核转运