1. 产溶剂梭菌的代谢调控与基因编辑技术研究
(1) 揭示梭菌新型双组分调控复合体感受木糖的分子机制
木糖是秸秆等木质纤维原料中除葡萄糖外最主要的糖组分，是自然界中储量最丰富的五碳糖。如何使之为微生物高效利用并合成有用的化学品，是人们一直关注的问题。产溶剂梭菌是一类重要的工业微生物，它可以通过发酵产生丁醇、乙醇和丙酮等大宗化学品及生物燃料。尽管该菌可以利用一定量的木糖，但效率低下。在之前的研究中，课题组发现在梭菌细胞内膜上存在一类保守的双组分蛋白复合体XylFII-LytS，用于感受环境中的木糖并调控其利用（Molecular Microbiology，2014）。这是木糖代谢过程中的一个重要环节，但其分子机制却知之甚少。
为此，课题组和张鹏研究员课题组合作解析了拜氏梭菌中的木糖信号感应复合体XylFII-LytS周质空间结构域（XylFII-LytSN）在结合与不结合木糖状态下的三维结构。通过对这些结构的比较与分析发现，木糖分子可以特异性地结合在XylFII蛋白上，并诱导其N端和C端结构域由开启状态转变为闭合状态。这种构象改变进而诱导两个XylFII-LytSN二聚体形成异源四聚体，成为有利于信号传导的分子构架。因此推断，结合两分子木糖的XylFII-LytS异源四聚体是其活性形式，木糖信号经由这一四聚体中的两分子组氨酸激酶LytS传导到膜内，通过激活应答调控蛋白启动木糖ABC转运蛋白XylFGH的表达来改善木糖的利用。进一步，研究团队利用生理生化及遗传学方法，通过定点突变目的蛋白的关键氨基酸残基，并结合梭菌体内实验和表型分析，证实了上述推断。该研究揭示了细菌感受重要五碳糖—木糖并调控其吸收利用的分子机制，为这一重要五碳糖的利用和工业菌株的分子改造提供了新的思路和依据。相关研究工作发表在PNAS上，并被国家基金委推荐为亮点工作。
(2) 揭示革兰氏阳性细菌CcpA蛋白的调控新机制
CcpA是革兰氏阳性细菌中重要的全局性转录调控因子，参与控制细胞的多项生理过程。它通过识别并结合至靶基因的特定位点执行其转录调控功能，进而形成复杂的调控网络，这类结合位点被称为cre（catabolite response elements）序列。目前已发现的被CcpA识别的cre通常是14-16个核苷酸的反向回文序列，其基序在长度和核苷酸组成上均比较相近。
课题组前期以革兰氏阳性菌—丙酮丁醇梭菌为研究对象，通过比较转录谱分析发现，大量受CcpA影响的基因在非编码区和编码区均不存在典型的cre位点，由此引出的问题是：这些基因中是否存在受CcpA直接调控的新位点？如果有，这些调控位点的结构与功能如何？为此，课题组以其中一个转录受CcpA显著影响的sol操纵子为突破口进行深入探究，发现了一种非典型的、具有特殊结构的结合基序。该基序与典型的cre差异较大，呈现高度可变性，即除了两端各6个核苷酸的保守反向回文序列（TGTAAA/TTTACA）外，其中间间隔区和向外延伸部分在长度和核苷酸组成上均是可变的，该新型结合基序被命名为cre-var。进一步的研究表明，cre-var两端的保守反向回文序列和中央间隔区的核苷酸及长度变化会显著影响其与CcpA的亲和力，从而揭示了其“柔性结构”的功能。随后的全基因组搜索发现，丙酮丁醇梭菌中存在一百多个cre-var位点，它们既可以单独行使功能也可以与经典的cre协同发挥作用，使得CcpA的调控更全面、灵活和精细。尤其重要的是，cre-var在其它革兰氏阳性菌中也大量存在，包括致病型梭菌、芽孢杆菌、链球菌、肠球菌和乳酸菌等，具有普适性，也为在这些细菌中开展相关研究奠定了基础。
该工作揭示了革兰氏阳性细菌全局调控蛋白CcpA的一种新型、高度可变的结合靶基序cre-var及其相关分子调控机制，为认识和理解其调控的多样化和精细化提供了新视角。相关研究工作发表在mBio上。
（3）化能固碳梭菌基因编辑系统的建立
糖基原料一直是工业微生物发酵的主要碳源。然而，由于资源和成本的因素，需要我们不断探索以新的更为廉价的原料配以高效的重组微生物来合成大宗化学品和燃料。一碳气体（如CO和CO2等）是重要的碳资源，其来源广泛，包括大型石化、冶炼企业的废气，由含碳物质如煤、石油、天然气以及生物质等气化制备的合成气（syngas）等。因此，构建能够高效利用一碳气体的固碳微生物并发酵转化为目标产物，将为解决全球资源和能源问题开辟一条新路，对工业可持续发展具有重大意义。
扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）是目前极少数接近工业应用的固碳微生物，可利用CO和CO2高效合成乙醇，因而受到广泛关注。但其遗传操作系统尚不完善，分子元件尤为匮乏，因而无法被有效设计和改造。我们首先筛选鉴定了在C. ljungdahlii中适用的异源强启动子，以用于有效驱动酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）来源的Cas9蛋白以及向导RNA在该菌中的表达，并以此避免了使用其内源启动子所存在的非特异性重组的可能性。在此基础上，通过对多个关键基因的测试，证明该系统可有效识别和切割靶序列，继而快速完成目标基因的删除，五天可完成，效率达到50%-100%。此外，通过在无选择压力下的传代培养，突变株中的外源质粒可以迅速消除，从而用于后续的基因操作。
该基因编辑系统成功克服了现有扬氏梭菌遗传操作方法的不足，给这一重要工业固碳菌的研究提供了极大便利，并为后续建立更多的精细分子操作技术奠定了基础。该工作在ACS Synthetic Biology杂志发表。
2. 产抗生素链霉菌的代谢调控及合成生物学研究
(1) 链霉菌天然产物合成基因簇多拷贝整合新方法的建立及应用
链霉菌可以产生大量具有生物活性的天然产物，然而其产量往往较低，需进一步提升以利于其鉴定、开发或大规模生产。由始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）产生的普那霉素(Pristinamycin)是一种抗耐药菌抗生素，包含普那霉素I（PI）和 II（PII）两个组分，其衍生物已被批准用于治疗G+耐药病原菌引起的感染。在前期研究工作中，课题组通过组合代谢工程与发酵工艺优化，初步提高了普那霉素II（PII）的合成能力。本研究中，我们进一步创新技术，建立了基于“一个整合酶-多个attB位点”理念的放线菌天然产物生物合成基因簇多拷贝整合的新方法MSGE。运用该方法，实现了PII生物合成基因簇的高效、快速扩增，获得了多达5个PII生物合成基因簇拷贝的工程菌SBJ1005。该工程菌的最高产量达到2.2 g/L，与出发菌株相比，提高了11倍。此外，基于MSGE理念，我们还构建了一系列含有多个外源ΦC31 attB位点的天蓝色链霉菌（S. coelicolor）异源表达底盘宿主，实现了氯霉素或抗癌小分子YM-216391合成基因簇多达4个拷贝的高效整合。与现有放线菌宿主相比，运用新底盘细胞测试的2种天然产物的产量提升了2-23倍。这些优秀底盘细胞的开发对于通过Genome Mining策略发现新型天然产物的研究工作具有重要意义。相关研究结果已发表在Metabolic Engineering上。
(2) 天蓝色链霉菌中双组分系统GluR-K响应谷氨酸并参与其转运的分子机制研究
通过突变体库的表型筛选，我们在天蓝色链霉菌中鉴定了一个差异调控抗生素合成的双组分系统GluR-K（SCO5778/5779）。有趣的是，该双组分系统只有在含有谷氨酸的基本培养基条件下才被激活。研究发现，GluR-K可直接感应谷氨酸信号，进而参与抗生素的合成以及谷氨酸转运子编码基因gluABCD的转录调控。在以高浓度（75 mM）谷氨酸为唯一氮源的基本培养基中，GluR-K不仅可以激活gluABCD的表达，进而促进谷氨酸向胞内大量转运，同时还参与放线紫红素（Actinorhodin, ACT）和隐性聚酮类抗生素（Cryptic polyketide, CPK）等抗生素合成的差异调控。而在低浓度（10 mM）谷氨酸条件下，GluR-K仅参与抗生素的合成，其具体调控机制还有待进一步解析。生物信息学分析显示，基因组中相邻的谷氨酸感应（GluR-K）及转运（GluABCD）模块在放线菌中广泛存在，具有普适性。这些研究结果丰富了人们对放线菌中参与谷氨酸感应及转运的信号传导通路的现有认知。相关研究结果已发表在Journal of Bacteriology上。
获奖情况：
上海市科技进步一等奖 (2015)
中国科学院科技促进发展奖(2016)
